A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
取材：现阶段仍要侵袭全世界的新型冠状菌株病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和南部大风靡，截至 2021 年 4 年初已避免最少 1.28 亿人细菌感染，最少 280 万人死亡者。意味着，尚分属可适当增纳 COVID-19 窒息率的化疗分析方法。我们科学知识研究了一种传统习俗的之药用树种口服制剂——生发肺毒口服液 (RDS) 的潜在炎冠状菌株活持续性，该口服液主要化学成分为圣城医学传统习俗之中常用化疗肺泡营养不良的之中中草药。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 太快菌株、SARS-CoV-2 太快菌株、混杂乙型肝炎菌株-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型菌株以及传染持续性 SARS-CoV-2 和都是以的 Ha-CoV-2 混种菌株 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对孔洞膜的细菌感染。我们实质持续性显然 RDS 可以从外部灭活 SARS-CoV-2 菌株外层的传染持续性。此外，我们推测 RDS 还可不利于乙型肝炎禽流感菌株对孔洞膜的细菌感染。
假设：RDS 可普遍诱发痉挛道菌株细菌感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状菌株，炎菌株化疗，生发肺毒口服液，传统习俗之药用树种，SARS-CoV，乙型肝炎禽流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型菌株
▋取材
现阶段仍要侵袭全世界的新型冠状菌株病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和南部大风靡，截至 2021 年 4 年初已避免最少 1.28 亿人细菌感染，最少 280 万人死亡者。意味着，尚分属可适当增纳 COVID-19 窒息率的化疗分析方法。新造经常出现的 COVID-19 菌株病原体为冠状菌株 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急持续性痉挛综合征涉及冠状菌株种类之中的姊妹菌株[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 刚开始都是在之华北地区推测的；SARS-CoV 菌株于 2002 年 11 年初在广东省首次被推测[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年初在武昌首次被推测[1,7,8]。在之华北地区，这两次由冠状菌株引致的非典型肺炎之中，之药用树种原则上被普遍应常用，用以紧急防范冠状菌株引致的营养不良。对于意味着的 COVID-19 大风靡，之华北地区有最少 85% 的 SARS-CoV-2 细菌感染高血压接纳了传统习俗之中医药医学上（9，10）。许多应常用的之药用树种确实不具适当的炎冠状菌株特持续性并在病理上确实适当，这个重要问题早已获得确实答复。
之药用树种作为化疗冠状菌株所引发营养不良的适当医学上，但由于不足体内或体外的系统对科学知识研究，其发展与合理应常用原则上受到了不利于。为了断定之药用树种的潜在炎 SARS-CoV-2 活持续性，我们从常用之药用树种之中挑选造出了多种中草药小分子物，并从之药用树种口服液 RDS(美国一种商业持续性持续性饮品本品) 之中推测了炎 SARS-CoV 和炎 SARS-CoV-2 菌株的活持续性，一种在美国的商业持续性饮品本品。RDS 常用提升人体痉挛系统对的总体健康，其包包涵多种中草药化学成分，如大豆和荆芥，它们是传统习俗上常用高度集中水肿和肺泡营养不良的之中中草药 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假菌株以及不具细菌感染持续性的野生型 SARS-CoV-2 菌株对孔洞膜的细菌感染不具可糖皮质激素。我们实质持续性显然 RDS 可通过从外部灭活菌株外层或制止菌株侵入而诱发菌株的早期细菌感染进度。此外，我们推测 RDS 还可以制止甲流菌株对孔洞膜的细菌感染。这些结果声称，RDS 对痉挛道菌株的细菌感染意味著不具普遍的可糖皮质激素。
▋结果
为了从传统习俗之中中草药之中找潜在的炎 SARS-CoV-2 活持续性，我们从约四十种传统习俗中草药之中挑选造出小分子造出 SARS-CoV-2S 受体假型太快菌株[14,15] 和人体肺泡 A549(ACE2) 孔洞膜，此本能 ACE2 基因会通过太快菌株转导作为多肽介导，从而比较稳定转导来解决问题超强调。太快假型菌株应常用浅绿色荧光受体 (GFP) 或荧光素酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因，并通过了不具广谱炎菌株转到诱发剂，以及萨拉多尔 (Arbidol)[16]，和本能炎毒血清对炎 SARS-CoV-2(三幅 1a、C) 的测试。我们需要要成功测定到萨拉多尔 (Arbidol) 和炎毒血清对于 SARS-CoV-2 假型菌株的可糖皮质激素，这是我们在其他四十余种传统习俗中草药小分子物飞行测试之中必须推测的，以外其之中一些共有存极低毒持续性的中草药 (三幅 1a-C)。然而，鉴于太快持续性假型菌株极少能测定 SARS-CoV-2 菌株的侵入行为，我们必须无关这些中草药小分子物意味著有在转到后阶段需要要诱发 SARS-CoV-2 的意味著持续性。我们实质持续性从传统习俗本品生发肺毒口服液 (RDS) 之中挑选造出造出了意味著的炎 SARS-CoV-2 活持续性，该产品线包涵有九种中草药化学成分——、当归、大豆、荆芥、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、生姜，在之华北地区传统习俗上常用化疗肺泡营养不良 (11-13)。
包涵有氨基的饮品胺、3，4-二邻的饮品酰基解毒剂胺、氨基 3，4-二邻的饮品酰基解毒剂胺、原儿茶胺、氨基绿原胺和木犀草素；花蕾之中还包涵有乙酰 A、B 和 10 种据信环都是以物体醚直链乙酰[17]；该树种还包涵有皂香茅香茅 A 和 B，以及炎水肿主导作用的乙酰 C[18,19]。当归胺乙酰之中包涵有木脂素、松脂醛和当归乙酰[20]。大豆之中包涵有被称为大豆皂乙酰的甾体皂乙酰，是大豆分属树种独有的树种物质[21,22]。榕荆芥之中主要活持续性化学成分为四种单直链，(−)-薄荷酮、(+)-普博利厄酮、(−)-柠檬都是以物体和 (+)-薄荷苯基；这种树种还包涵有其他硫，如 1-辛都是以物体-3-醛、3-辛酮、β-年初桂都是以物体和β-漆树都是以物体[23]。玄参包涵有最少 162 种硫，以外环都是以物体醚直链和环都是以物体醚直链乙酰、苯丙乙酰、有机胺、直链类、甘油、抗氧化剂、和皂乙酰[24]。苦杏仁之中包涵有都是以物体、丙烷硫和麦芽糖甘油[25]。皂角刺之中包涵有皂乙酰和羽扇豆胺[26,27]，而生姜之中包涵有主要活持续性化学成分生姜胺[28]。为了实质持续性飞行测试 RDS 的炎 SARS-CoV-2 活持续性，用相同一一原理沸点的 RDS 后附近理过程 A549(ACE2) 细胞膜，然后让这些细胞膜在共有存 RDS 的可能会下接纳 4-6 天内的细菌感染。细菌感染后，在不共有存 RDS 的可能会下人才培养细胞膜，然后在 48 和 72 天内的时候，通过流固定式细胞膜妖术对菌株细菌感染的可糖皮质激素同步进行二阶。为了高度集中细胞膜毒持续性，应常用氯化丙啶 (PI) 对即将死亡者和已死亡者的细胞膜同步进行染色，极少在活细胞膜群之中量化 GFP+细胞膜。如三幅 2 下三幅，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假菌株不具低剂量选择持续性可糖皮质激素。为了显然这些结果，我们应常用内源持续性强调 ACE2 的 VeroE6 细胞膜减法了该细菌感染试验。
(闻下页三幅)
ACE2 内部强调，采购持续性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 菌株可对其同步进行细菌感染，ACE2 有时候常用冠状菌株的科学知识研究 (7)。考虑到在不足 ACE2 超强调 [15，29，30] 的可能会下，假型菌株对 VeroE6 的细菌感染持续性较低，我们还应常用了荧光素酶华盛顿邮报基因假型菌株，该菌株的华盛顿邮报线粒体由 HIV-1LTR 和 Tat 转子，不具极高的华盛顿邮报基因敏感持续性和增益。
三幅 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型菌株细菌感染 A549(ACE2) 细胞膜。
A.A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 周内一一原理 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型菌株细菌感染。将细胞膜洗去菌株和 RDS，并在不共有存 RDS 的可能会下同步进行人才培养。流固定式细胞膜仪测定菌株细菌感染诱发可能会。从未细菌感染的细胞膜和细菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但从予以 RDS 化疗的细胞膜作为印证。GFP+细胞膜%-已显示。(PI) 氯化丙啶。
B.RDS 的细胞膜毒持续性一原理。A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 周内一一原理 4 天内，洗去 RDS，无 RDS 人才培养 48 天内。氯化丙啶染色鉴别准备死亡者细胞膜和已死亡者细胞膜，流固定式细胞膜妖术量化。画低剂量-反应会细胞膜毒持续性曲率，RDS 的半窒息沸点 (LC50) %为 1:11.9。
如三幅 3A 下三幅，我们应常用 Luc 报告基因假菌株和 VeroE6 细胞膜同步进行细菌感染试验，掩蔽到 RDS 对该菌株细菌感染不具低剂量选择持续性可糖皮质激素，并且分之一诱发沸点断定为 1:230RDS 一一原理度 (三幅 3B)。我们还二阶了 RDS 对 VeroE6 细胞膜生命力的受到影响，断定了 50% 细胞膜死亡者低剂量为 1:11.8RDS 一一原理度。
三幅 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假菌株和野生型 SARS-CoV-2 菌株的低剂量选择持续性诱发可糖皮质激素。用 RDS 周内一一原理后附近理过程 A、BVeroE6 细胞膜，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型菌株细菌感染。将细胞膜洗去菌株和 RDS，并在不共有存 RDS 的可能会下同步进行人才培养。在细菌感染后 72 天内用荧光素酶测定菌株细菌感染的可糖皮质激素。从未细菌感染细胞膜和 SARS-CoV-2-luc 细菌感染但从予以过 RDS 化疗的细胞膜作为印证。试验减法三次。画低剂量反应会曲率和 RDS 的 I-C50 一一原理%为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞膜的细胞膜毒持续性也通过氯化丙啶染色和流固定式细胞膜妖术一原理。用 RDS 周内一一原理 4 天内，洗去 RDS，在不包涵 RDS 的可能会下人才培养 72 天内。画细胞膜毒持续性低剂量-反应会曲率，RDS 的半窒息沸点 (LC50) %为 1:13.8 一一原理。DRDS 诱发传染持续性 SARS-CoV-2 细菌感染。用周内一一原理的 RDS 后附近理过程 VeroE6 细胞膜，并在 RDS 共有存的可能会下细菌感染 SARS-CoV-2。细菌感染 48 天内后，通过恶菌斑量化菌株拘押后的菌株克隆诱发可能会。诱发次飞行测试一固定式一整同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 之中应常用单向标准化差 (One-Way ANOVA) 量化及 Dunnett 后检查和 (Dunnett's Post Test)，以此断定统计显着持续性。显着持续性个数用除此以外表示如下：*p
为了实质持续性测试应常用假菌株获得的结果，我们飞行测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 细菌感染的不利于传染持续性能力。如三幅 3D 下三幅，RDS 同时也不利于了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞膜的细菌感染。RDS 在一一原理 1:40 以上时可显着减少菌株白斑的转变成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假菌株与传染持续性菌株的结果声称，RDS 包涵有诱发 SARS-CoV-2 细菌感染的活持续性化学成分，意味著是通过从外部灭活菌株或不利于菌株的早期细菌感染进度。
为实质持续性科学知识研究意味著的机制，我们将传染持续性 SARS-CoV-2 菌株外层与周内一一原理的 RDS 在 37°C 下预人才培养 1 天内。随后，将硫胺实质持续性依次一一原理-(10–1 至 10–4)，并自组 Vero 细胞膜同步进行恶菌斑量化以断定菌株细菌感染持续性的增纳。如三幅 4A 下三幅，我们掩蔽到在 RDS 之中之后渗透到一天内后的菌株外层，其 SARS-CoV-2 的细菌感染效价也深褐色低剂量选择持续性下降。该结果显然 RDS 可适当从外部灭活 SARS-CoV-2 菌株外层的传染持续性。
我们实质持续性飞行测试了 RDS 确实也能诱发 SARS-CoV-2 菌株混种的细菌感染。为此，我们为了让近期开发设计的混杂甲菌株-SARS-CoV-2 假型菌株 (Ha-CoV-2)[31] 来分离造出一系列 S 受体相异，以外英国相异 (B.1.1.7)，津巴布韦相异 (B.1.351)，乌拉圭相异 (P.1)，伊利诺州相异 (B.1.429)，和其他几个新兴相异 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和涉及 S 受体变异体在 37°C 周内一一原理 RDS 人才培养 1 天内。随后，用该硫胺细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 孔洞膜。细菌感染后 12 天内，荧光素酶校准菌株细菌感染的可糖皮质激素。如三幅 4B 下三幅，我们还掩蔽到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 受体相异的低剂量选择持续性诱发。
我们还飞行测试了 RDS 不利于 SARS-CoV 细菌感染的能力，应常用带有 SARS-CoV 突刺受体的 GFP 华盛顿邮报基因太快菌株和[15] 伪低剂量。我们将人 A549(ACE2) 细胞膜做为孔洞膜，将其用系列一一原理的 RDS 后附近理过程，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假菌株细菌感染 4-6 天内。细菌感染后在不包涵 RDS 的可能会下人才培养细胞膜，流固定式细胞膜妖术二阶测定其对菌株细菌感染的可糖皮质激素。比方说，应常用氯化丙啶无关准备死亡者与已死亡者的细胞膜，极少在活细胞膜群之中量化 GFP+细胞膜。如三幅 5A 下三幅，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型菌株的可糖皮质激素深褐色低剂量选择持续性。我们实质持续性显然这些结果，并二阶了 RDS 介导的诱发与 Luc 华盛顿邮报基因 SARS-CoV 假型菌株，SARSCoV(Luc)。我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的可糖皮质激素深褐色低剂量持续性仰赖，其半诱发沸点 (IC50) 为 1:70.88 一一原理度 (三幅 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应常用 ACE2 细菌感染孔洞膜，我们还飞行测试了 RDS 的炎菌株活持续性确实极少针对与 ACE2 有相互主导作用的冠状菌株。为此，我们测定了一种不涉及的负链 RNA 菌株--乙型肝炎禽流感菌株。它通过菌株血凝素 (HA) 和细胞膜α-唾液胺来细菌感染孔洞膜。为了分离造出乙型肝炎禽流感菌株，将强调乙型肝炎禽流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个多肽和一个 GFP-华盛顿邮报基因共有转染到 HEK293T 细胞膜之中。在 RDS 共有存的可能会下，利用菌株外层并常用细菌感染能够 MDCK 细胞膜。如三幅 6A 下三幅，我们掩蔽到 RDS 对乙型肝炎禽流感菌株的可糖皮质激素深褐色低剂量选择持续性。RDS 在 1:40 和 1:80 一一原理时可极少极少不利于菌株细菌感染，在 1:160 一一原理时则可部分诱发乙型肝炎禽流感。RDS 对 MDCK 细胞膜的半窒息沸点 (LC50) 经校准为 1:18.5(三幅 6B)。这些结果声称，RDS 的炎菌株活持续性并非针对特定菌株，而意味著需要要普遍诱发多种痉挛道菌株，如冠状菌株和乙型肝炎禽流感菌株。
▋讨论
在本报告之中，我们显然传统习俗本品生发肺毒口服液 (RDS) 包涵有广谱炎菌株活持续性，可不利于 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型肝炎禽流感菌株的细菌感染。虽然 RDS 需要要诱发多种菌株，但其炎菌株活持续性因菌株类型和疾病而异。例如，对 SARS-CoV 太快假菌株的 I-C50 沸点为 1:7.9 一一原理度，对 SARS-CoV-2 太快假菌株的 I-C50 沸点为 1:230 一一原理度。对于传染持续性野生型 SARS-CoV-2 菌株，I-C50 为 1:40 一一原理度，对乙型肝炎禽流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其混种有相同的可糖皮质激素，IC50 数个数从 1:70 到 1:2601 一一原理度不等 (三幅 4B)。
(闻下一页三幅)
三幅 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和都是以的 Ha-CoV-2 混种不具低剂量选择持续性灭活主导作用。ASARS-CoV-2 外层纳周内一一原理的 RDS 在 37°C 下人才培养 1 天内。随后，将硫胺实质持续性周内一一原理，并自组 Vero 细胞膜之中同步进行恶菌斑量化，以断定菌株细菌感染持续性增纳。诱发次飞行测试一固定式一整同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 之中应常用单向标准化差 (One-WayANOVA) 量化和 Dunnett 后检查和 (Dunnett'sPostTest) 以此断定统计显着持续性。显着持续性个数用除此以外表示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和涉及 S 受体相异与周内一一原理的 RDS 在 37°C 人才培养 1 天内后，用硫胺细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 孔洞膜。细菌感染后 12 天内，荧光素酶校准菌株细菌感染的可糖皮质激素。RDS 的 IC50 个数的一一原理度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们实质持续性显然 RDS 可以诱发冠状菌株的早期细菌感染进度。虽然具体的炎菌株机制早已可信，但 RDS 可以通过从外部灭活菌株外层或通过制止菌株侵入或不利于菌株侵入后的早期进度来制止菌株细菌感染。在其他几种传统习俗之药用树种之中也推测了炎 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活持续性。例如，一种常闻的传统习俗之药用树种——生姜。
生姜根之中已显然包涵有生姜胺素，可诱发 SARS 菌株[32] 病理分离株的克隆。此外，另一种可常用化疗痉挛道营养不良的之药用树种——双黄连制剂，已显示造出在体外以低剂量选择持续性方固定式将诱发 SARS-CoV-23CL 受体酶 (3CLpro) 活持续性。龙胆乙酰和龙胆素拟作为双黄连不利于 3CLpro[33] 的适当化学成分。
三幅 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型菌株对 A549(ACE2) 细胞膜的细菌感染。用周内一一原理的 RDS 后附近理过程 A、B 细胞膜，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型菌株细菌感染。将细胞膜消毒，去掉菌株和 RDS，在不共有存 RDS 的可能会下同步进行人才培养。在细菌感染后 48 天内和 72 天内，通过流固定式细胞膜妖术或荧光素酶测定来一原理菌株细菌感染的可糖皮质激素。试验减法三次。画低剂量响应曲率，并画 RDS 的 IC50 个数为 1:70.9 一一原理度 (C)
三幅 6 RDS 诱发甲流菌株对 MDCK 细胞膜的细菌感染。(A) 用周内一一原理的 RDS 后附近理过程 MDCK 细胞膜 30 分钟，然后用甲流菌株 (GFP) 对其同步进行细菌感染。细菌感染后，在 RDS 共有存下人才培养细胞膜。36 天内后用流固定式细胞膜仪对菌株细菌感染的可糖皮质激素同步进行一原理。把从未细菌感染的细胞膜与被甲流菌株 (GFP) 细菌感染但从予以 RDS 附近理过程的细胞膜同步进行对比。三幅之中显示了 GFP+细胞膜的%-。PI 表示氯化丙啶 PI。
(B) 另外还应常用了 MTT 校准法一原理了 RDS 对 MDCK 细胞膜的毒持续性，画了细胞膜毒持续性的低剂量-反应会曲率，经计数，RDS 的分之一窒息沸点为 1:18.5 一一原理度 RDS 的适当炎菌株化学成分早已断定。然而，RDS 相同于龙胆乙酰和龙胆素，RDS 可以通过从外部灭活菌株中微子来不利于菌株细菌感染 (三幅 4)，而龙胆乙酰和龙胆素则在菌株生命周期的后期通过不利于菌株受体酶的活持续性来意味著。然而，RDS 的体外炎 SARS-CoV-2 活持续性仍需要在今后的爬虫类科学知识研究和本能病理试验之中获得显然。现阶段，我们准备同步进行小型爬虫类试验，以断定 RDS 在体内不利于 SARS-CoV-2 菌株细菌感染的潜力。
▋假设
我们的科学知识研究声称，RDS 可普遍诱发痉挛道菌株的细菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型肝炎禽流感。
▋分析方法
细胞膜和细胞膜人才培养
HEK293T (ATCC 博拉米尔，新泽西州) MDCK (ATCC 博拉米尔，新泽西州)，VeroE6 (ATCC 博拉米尔，新泽西州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠予，博拉米尔，新泽西州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠予，博拉米尔，新泽西州) 现阶段存放于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific) 包涵有 10% 热灭活 FBS 和 1×抗生素-研究成果 (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜人才菌落之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点自组嘌呤霉素和潮霉素 B。
质粒转染和菌株分离造出
包涵 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的太快持续性假型菌株外层由 Virongy LLC (Manassas，VA) 以外，或按照右边描述的分析方法[15] 分离造出。简言之，为了分离造出 GFP 华盛顿邮报基因太快持续性假菌株，HEK293T 细胞膜与强调 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共有转染。为了产造出荧光素酶华盛顿邮报基因太快持续性假型菌株，将 HEK293T 细胞膜与强调 SARSCoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行共有转染。转染后 48 天内利用菌株上清液，离心精炼，−80℃ 存放。野生型 SARS-CoV-2 菌株 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 以外。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 都是以质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi Clark针锋相对以外。在禽流感菌株 A-GFP 华盛顿邮报基因中微子分离造出之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共有转染 HEK293T 细胞膜 (ΔAT6)。48 天内后利用菌株上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 强调多肽仿造 Sinobiological。为了让 Twist Bioscience 小分子了 Ha-CoV-2(Luc) 多肽和 S 受体变异多肽。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体变异中微子按照右边描述分析方法[31] 同步进行分离造出。
菌株细菌感染和本品诱发次飞行测试
RDS(生发肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赠予，利斯堡，新泽西州) 是由马Clark试验室 (Burnaby，BC，Canada) 采购的一种商业持续性产品线。RDS 之中所有之中中草药化学成分原则上符合《之华北地区药典 2015 年版》「饮片」标准化，以外适当化学成分包涵量及摇滚、农药限量测定。RDS 是一种之药用树种的共有煎剂，最后中间体在真空情况下下水蒸气。SARS-CoV-2 炎血清由 LanceA. Liotta 牙医以外。将萨拉朵尔甲胺 (Sigma) 重新碎屑在二氨基亚砜 (Sigma) 之中。对于假型菌株细菌感染，12 孔板之中的 A549(ACE2) 细胞膜 (来自 Virongy LLC 赠予，博拉米尔，新泽西州) 或 VeroE6 细胞膜用 RDS 后附近理过程 30 分钟，在 37℃ 下细菌感染 4-6 天内，然后在新鲜人才菌落之中温水人才培养 48-72 天内。对于 VeroE6 细胞膜的细菌感染，细胞膜也被 CoV-2 假型菌株细菌感染提升剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠予，博拉米尔，新泽西州) 后附近理过程后，在 37°C 下再附近理过程 30 分钟。应常用 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 量化细胞膜裂解物的荧光素酶活持续性。对于野生型 SARS-CoV-2 细菌感染，VeroE6 细胞膜在 37°C 下用 RDS 后附近理过程 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 细菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在威廉布洛克的大学的 BSL-3 收容服务设施内停留 1 天内。细胞膜用 PBS 温水 2 次，用包涵 RDS 的人才菌落人才培养 48 天内。从上清之中小分子菌株，用 12 孔板人才培养的 Vero 细胞膜单层之中的恶菌斑次飞行测试校准小瓶滴度。简言之，每个样品在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 人才菌落 (VWR) 之中分离造出，包包涵 1X 抗生素-研究成果 (VWR)，并掺入 10% 的 FBS(赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一一原理液溶解到 VeroE6 细胞膜单层的三个平行孔上 1 天内。然后用 1～2 ml0.6% 长丝糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 人才菌落 (VWR) 的硫胺布满单层，包涵 1X 抗生素-研究成果，并掺入 10%FBS。48 天内后，将单层膜固定在 10% 甲醛溶剂之中 1 天内，并去除布满的长丝拉。为了染色白斑，自组包涵有 20% 乙醛的 1% 晶体紫染色溶剂 5 分钟，然后用去离子水温水。对于乙型肝炎禽流感菌株细菌感染 MDCK 细胞膜，在 37°C 下用 RDS 后附近理过程 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因菌株细菌感染 6 天内。用包涵 RDS 的人才菌落温水细胞膜，人才培养 36 天内。GFP 强调通过流固定式细胞膜仪一原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 菌株外层的 RDS 灭活次飞行测试，将 100μl 周内一一原理的 RDS 掺入到 1 mlSARS-CoV-2 菌株原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，最后 RDS 一一原理为 1:20，1:40 或 1:80。也以外印证情况下 (1 ml 菌株+100μl 人才菌落)。硫胺在 37°C 下人才培养 1 天内。随后，对硫胺同步进行系列一一原理以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一一原理度，并将周内一一原理的样品自组 12 孔板之中的 Vero 细胞膜之中，常用同步进行恶菌斑校准量化。白斑校准之中最后的 RDS 一一原理度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一一原理液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体变异中微子按照右边描述的分析方法[31] 分离造出。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 周内一一原理的 RDS 掺入到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或相异之中，最后 RDS 一一原理度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将硫胺在 37°C 下人才培养 1 天内，然后在 RDS 共有存下细菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜 12 天内。应常用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 量化细胞膜裂解物的荧光素酶活持续性。
细胞膜毒持续性量化测定
用氯化丙啶染色和流固定式细胞膜妖术二阶对 A549 (ACE2) 细胞膜和 VeroE6 细胞膜的本品细胞膜毒持续性同步进行测定，如所述 (34)。应常用细胞膜增殖盐酸盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的拟议对 MDCK 细胞膜的本品毒持续性同步进行二阶。简言之，将 MDCK 细胞膜 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞膜的速度疫苗接种到 12 孔板之中。细胞膜人才培养隔夜后，通过 RDS 附近理过程 1 天，然后在 MTT 标记盐酸 (Sigma) 的人才菌落之中人才培养。将细胞膜与标记盐酸共有同人才培养 4 天内，再近期自组 MTT 增溶剂。人才排泄物圈养用餐，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 校准吸类星体。
缩写
SARS-CoV：严重急持续性痉挛系统对病症涉及冠状菌株；SARSCoV-2：Severe 严重急持续性痉挛系统对病症涉及冠状菌株-2；TCM：传统习俗之药用树种；RDS：痉挛道排毒口服液；Ha-CoV-2：混杂乙型肝炎新冠菌株假菌株。
致谢
感恩 FengLi 以外禽流感菌株强调多肽，感恩 LanceLiotta 以外炎毒血清；感恩 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与建议；感恩 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 以外 RDS 和中草药小分子物。
所作贡献
此次试验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 编辑，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 拒绝执行了该试验。所有所作已阅读并审批最后审阅。
资金
本科学知识研究的经费来自于威廉布洛克的大学内部拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 以外。
数据集和材料的可用持续性
本科学知识研究之中产生或量化的所有数据集原则上包包涵在本文之中。盐酸可从 Y.W 附近给与。
书面声明
审批及参与决定
不极少限于
决定造出版
不极少限于
公平竞争利益
威廉布洛克的大学国家政府生物体防御和疾病之中心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的科学知识研究赞助，LAH 为德佳和畅转任主管并获得了酬金。必须其他间的关系或社会活动意味著会受到影响到呈交的工作。
所作示意图
1美国新泽西州威廉布洛克的大学系统对生物体学该学院国家政府生物体防御和疾病之中心，博拉米尔 20110。
2VirongyLLC，新泽西州博拉米尔。3纳拿大伯纳比，BCV5J0E5 马Clark试验室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 美国新泽西州利斯堡华北地区奥委会科学知识组织，20176。
收稿年份：2021 年 4 年初 7 日
接纳年份：2021 年 5 年初 10 日
线上造出版时间：2021 年 5 年初 29 日
概述
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编辑： 翟超男相关新闻
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